トブラマイシン定量の HPLC-CAD アプリケーションノート

1. 序文

トブラマイシンはアミノグリコシド系抗生物質です。アミノグリコシド系抗生物質は共役構造を持たず UV 吸収が弱いため、通常の直接 UV 検出には適していません。

2020 年版の中国薬典では、トブラマイシン原薬の類縁物質試験に ELSD が用いられ、定量項目には微生物定量法が用いられています。現行 USP では類縁物質に薄層クロマトグラフィー、定量に誘導体化後の UV 検出が用いられます。米国薬局方委員会は 2023 年 1 月、HPLC-CAD 法を用いる意見募集案を発表しました。

本アプリケーションでは、Instrumax CAD と Agilent ZORBAX SB-C18 カラムを用いたトブラマイシン定量法を評価しました。本法は高い特異性、高感度、良好な再現性と直線性を示します。

2. 装置と材料

装置：Agilent 1200 液体クロマトグラフ + Instrumax CADetector a1 荷電エアロゾル検出器。

試薬：純水（Watson’s distilled water）、アセトニトリル（クロマトグラフィーグレード）、トリフルオロ酢酸（分析用）。試料：トブラマイシン。

3. 方法と結果

3.1 クロマトグラフィー条件

カラム：Agilent ZORBAX SB-C18、4.6 mm × 250 mm、3.5 μm。カラム温度：10 °C。流量：0.8 mL/min。注入量：25 μL。

移動相 A：0.3% TFA 水溶液。移動相 B：0.3% TFA アセトニトリル溶液。グラジエント溶出。

CAD 条件：ドリフトチューブ温度 40 °C、ネブライザーガス流量 3 L/min、コロナ電流 1 μA、コロナガス流量 1 L/min、ゲイン 0.2。

3.2 試料調製

空白溶媒：移動相 A。トブラマイシン標準品原液：180.0 μg/mL。

直線性溶液：10.8、14.4、18.0、21.6、27.0 μg/mL。

3.3 特異性

空白は主ピーク測定を妨害せず、特異性は良好でした。

図 1：空白グラジエント（未注入）。図 2：空白溶媒（移動相 A）。図 3：180.0 μg/mL トブラマイシン標準品原液。

3.4 理論段数と注入精度

10.8 μg/mL の直線性溶液 1 では、USP 理論段数は 16600.5（>3000）で、カラム性能は良好でした。

18.0 μg/mL 標準溶液を 5 回連続注入したピーク面積 RSD は 0.980%（<2.0%）で、精度は良好でした。

3.5 直線性

直線性溶液 1 から 5 をそれぞれ 1 回注入し、溶液濃度とピーク面積で線形回帰を行いました。線形相関係数は R = 0.99918（>0.995）で、良好な直線性を示しました。

4. 考察と結論

空白グラジエントには 15–16 min にグラジエントピークがありましたが、実験に影響しませんでした。空白溶媒には 2–5 min に 4 つのピークがありましたが、トブラマイシン主ピークの保持時間から十分離れており、検出を妨害しませんでした。

結果より、Instrumax CAD はトブラマイシン試料に対して良好な検出、再現性、直線性を示し、メソッド評価と品質管理の要求を満たします。

参考文献：USP-NF 意見募集案 Tobramycin [S]。