HPLC-CAD-Anwendungsbericht zur Tobramycin-Gehaltsbestimmung

1. Einleitung

Tobramycin ist ein Aminoglykosid-Antibiotikum. Da Aminoglykoside keine konjugierte Struktur besitzen und nur eine schwache UV-Absorption aufweisen, ist die direkte routinemäßige UV-Detektion nicht ideal.

Die Chinesische Pharmakopöe 2020 verwendet ELSD für verwandte Substanzen in Tobramycin-Wirkstoffen, während die Gehaltsbestimmung eine mikrobiologische Methode nutzt. Aktuelle USP-Standards verwenden Dünnschichtchromatographie für verwandte Substanzen und UV-Detektion nach Derivatisierung für die Gehaltsbestimmung. Im Januar 2023 veröffentlichte die United States Pharmacopeia Commission einen Entwurf, der HPLC-CAD vorschlägt.

Diese Anwendung bewertet eine Tobramycin-Gehaltsbestimmung mit Instrumax CAD und einer Agilent ZORBAX SB-C18-Säule. Die Methode zeigt hohe Spezifität, Empfindlichkeit, Wiederholbarkeit und Linearität.

2. Instrumente und Materialien

Instrument: Agilent 1200 Flüssigchromatograph + Instrumax CADetector a1 Charged-Aerosol-Detektor.

Reagenzien: reines Wasser (Watson’s distilled water), Acetonitril (Chromatographiequalität), Trifluoressigsäure (Analysequalität). Probe: Tobramycin.

3. Methoden und Ergebnisse

3.1 Chromatographische Bedingungen

Säule: Agilent ZORBAX SB-C18, 4.6 mm × 250 mm, 3.5 μm. Säulentemperatur: 10 °C. Flussrate: 0.8 mL/min. Injektionsvolumen: 25 μL.

Mobile Phase A: 0.3% TFA-Wasserlösung. Mobile Phase B: 0.3% TFA in Acetonitril. Gradientenelution.

CAD-Bedingungen: Driftrohrtemperatur 40 °C, Zerstäubergasfluss 3 L/min, Koronastrom 1 μA, Koronagasfluss 1 L/min, Verstärkung 0.2.

3.2 Probenvorbereitung

Blindlösungsmittel: mobile Phase A. Tobramycin-Referenzstandard-Stammlösung: 180.0 μg/mL.

Linearitätslösungen: 10.8, 14.4, 18.0, 21.6 und 27.0 μg/mL.

3.3 Spezifität

Der Blindwert stört die Bestimmung des Hauptpeaks nicht und zeigt gute Spezifität.

Abbildung 1. Blindgradient (keine Injektion). Abbildung 2. Blindlösungsmittel (mobile Phase A). Abbildung 3. Tobramycin-Referenzstandard-Stammlösung mit 180.0 μg/mL.

3.4 Theorieböden und Injektionspräzision

Für Linearitätslösung 1 mit 10.8 μg/mL betrug die USP-Theoriebodenzahl 16600.5 (>3000), was eine gute Säulenleistung zeigt.

Fünf aufeinanderfolgende Injektionen der 18.0 μg/mL-Referenzlösung ergaben eine Peakflächen-RSD von 0.980% (<2.0%) und damit gute Präzision.

3.5 Linearität

Die Linearitätslösungen 1 bis 5 wurden jeweils einmal injiziert, und anhand von Konzentration und Peakfläche wurde eine lineare Regression erstellt. Der lineare Korrelationskoeffizient betrug R = 0.99918 (>0.995), was gute Linearität zeigt.

4. Diskussion und Fazit

Der Blindgradient wies bei 15–16 min einen Gradientenpeak auf, der das Experiment nicht beeinflusste. Das Blindlösungsmittel zeigte vier Peaks bei 2–5 min, die weit von der Retentionszeit des Tobramycin-Hauptpeaks entfernt waren und die Detektion nicht störten.

Die Ergebnisse zeigen, dass Instrumax CAD gute Detektion, Wiederholbarkeit und Linearität für Tobramycin-Proben bietet und die Anforderungen an Methodenbewertung und Qualitätskontrolle erfüllt.

Referenz: USP-NF-Entwurf zur Kommentierung, Tobramycin [S].