Note d’application HPLC-CAD pour le dosage de la tobramycine

1. Introduction

La tobramycine est un antibiotique aminoglycoside. Comme les aminoglycosides ne possèdent pas de structure conjuguée et présentent une faible absorption UV, la détection UV directe de routine n’est pas idéale.

La Pharmacopée chinoise 2020 utilise l’ELSD pour les substances apparentées de la matière première de tobramycine, tandis que le dosage repose sur une méthode microbiologique. Les normes USP actuelles utilisent la chromatographie sur couche mince pour les substances apparentées et la détection UV après dérivatisation pour le dosage. En janvier 2023, l’United States Pharmacopeia Commission a publié un projet proposant l’HPLC-CAD.

Cette application évalue une méthode de dosage avec Instrumax CAD et une colonne Agilent ZORBAX SB-C18. La méthode montre une forte spécificité, une sensibilité élevée, une bonne répétabilité et une bonne linéarité.

2. Instruments et matériaux

Instrument : chromatographe liquide Agilent 1200 + détecteur d’aérosols chargés Instrumax CADetector a1.

Réactifs : eau pure (Watson’s distilled water), acétonitrile (qualité chromatographique), acide trifluoroacétique (qualité analytique). Échantillon : tobramycine.

3. Méthodes et résultats

3.1 Conditions chromatographiques

Colonne : Agilent ZORBAX SB-C18, 4.6 mm × 250 mm, 3.5 μm. Température de colonne : 10 °C. Débit : 0.8 mL/min. Volume d’injection : 25 μL.

Phase mobile A : solution aqueuse de TFA 0.3%. Phase mobile B : TFA 0.3% dans l’acétonitrile. Élution en gradient.

Conditions CAD : température du tube de dérive 40 °C, débit de gaz de nébulisation 3 L/min, courant corona 1 μA, débit de gaz corona 1 L/min, gain 0.2.

3.2 Préparation des échantillons

Solvant blanc : phase mobile A. Solution mère de référence de tobramycine : 180.0 μg/mL.

Solutions de linéarité : 10.8, 14.4, 18.0, 21.6 et 27.0 μg/mL.

3.3 Spécificité

Le blanc n’interfère pas avec le pic principal, indiquant une bonne spécificité.

Figure 1. Gradient blanc (sans injection). Figure 2. Solvant blanc (phase mobile A). Figure 3. Solution mère de référence de tobramycine à 180.0 μg/mL.

3.4 Plateaux théoriques et précision d’injection

Pour la solution de linéarité 1 à 10.8 μg/mL, le nombre de plateaux théoriques USP était de 16600.5 (>3000), indiquant une bonne performance de colonne.

Cinq injections consécutives de la solution de référence à 18.0 μg/mL ont donné un RSD de l’aire du pic de 0.980% (<2.0%), indiquant une bonne précision.

3.5 Linéarité

Les solutions de linéarité 1 à 5 ont été injectées une fois chacune, puis une régression linéaire a été réalisée à partir de la concentration et de la surface de pic. Le coefficient de corrélation était R = 0.99918 (>0.995), montrant une bonne linéarité.

4. Discussion et conclusion

Le gradient blanc présentait un pic de gradient à 15–16 min, sans effet sur l’expérience. Le solvant blanc présentait quatre pics à 2–5 min, suffisamment éloignés du temps de rétention du pic principal de la tobramycine pour ne pas interférer.

Les résultats montrent qu’Instrumax CAD fournit une bonne détection, répétabilité et linéarité pour les échantillons de tobramycine, répondant aux besoins d’évaluation de méthode et de contrôle qualité.

Référence : projet USP-NF soumis à commentaires, Tobramycin [S].