HPLC-CAD-Prüfbericht für eine Piperidinprobe

1. Geräte und Materialien

Gerät: Agilent 1200 Flüssigkeitschromatograph mit Instrumax CADetector a1 Charged-Aerosol-Detektor (CAD).

Reagenzien: Reinstwasser, Acetonitril (Chromatographiequalität) und Trifluoressigsäure (Analysenqualität).

Proben: Standards und Piperidinprobe, vom Anwender bereitgestellt.

2. Methoden und Ergebnisse

2.1 Chromatographische Bedingungen

Säule: Phenomenex Kinetex® XB-C18, 5 μm, 4,6 × 250 mm.

Säulentemperatur: 35 °C. Flussrate: 1,0 mL/min. Injektionsvolumen: 10 μL.

Mobile Phase A: 0,1 % TFA wässrige Lösung. Mobile Phase B: 0,1 % TFA Acetonitril-Lösung.

Gradientenbedingungen:

CAD-Bedingungen: CADetector a1; Driftrohr 50 °C; Zerstäubergas 3 L/min; Koronastrom 1 μA; Koronagas 1 L/min; Gain 0,2; RF 2,0.

2.2 Probeninformationen

Blank-Lösungsmittel, ein 15-µg/mL-Standard, die Prüfprobe sowie Standardstufen von 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 80 %, 120 %, 150 % und 200 % wurden vorbereitet. Die entsprechenden Konzentrationen betrugen 1,5, 3,0, 4,5, 7,5, 12,0, 18,0, 22,5 und 30,0 µg/mL.

2.3 Experimentelle Ergebnisse

2.3.1 Spezifität

Das Blank-Lösungsmittel störte den Zielpeak von Piperidin nicht und zeigte eine gute Spezifität.

2.3.2 Empfindlichkeit

Für die Probe der 10-%-Konzentrationsstufe betrug das mit der Agilent CDS P2P-Methode berechnete Signal-Rausch-Verhältnis 43,51 und erfüllte damit die Empfindlichkeitsanforderung.

Abbildung 1. Blank-Lösungsmittel / Verdünnungsmittel.

Abbildung 2. Standard der 10-%-Konzentrationsstufe und S/N-Ergebnis.

2.3.3 Linearität

Neun Konzentrationsstufen des Standards wurden jeweils einmal injiziert; zusätzlich wurde der Standard mit unterschiedlichen Injektionsvolumina injiziert. Lineare Gleichungen wurden aus Konzentration gegen Peakfläche und Injektionsvolumen gegen Peakfläche erstellt. Die Konzentrationslinearität ergab R²=0,9980 und die Linearität des Injektionsvolumens R²=0,9995, was eine gute Linearität zeigt.

2.3.4 Wiederholbarkeit

Der Standard wurde sechsmal hintereinander injiziert, und RSD% für Retentionszeit, Peakfläche und Peakhöhe wurden berechnet. Die RSD der Retentionszeit betrug 0,184 %, die RSD der Peakfläche 1,38 % und die RSD der Peakhöhe 1,65 %; alle Werte lagen unter 2,0 % und zeigen eine gute Wiederholbarkeit.

2.3.5 Probenprüfung

Eine 10-μL-Injektion der Piperidinprobe ergab einen klaren Zielpeak mit einer Peakfläche von 23,542. Die aus der linearen Kalibrierkurve berechnete Konzentration betrug 2,9890 µg/mL.

Abbildung 3. Wiederholbarkeits-Chromatogramm für sechs Standardinjektionen.

Abbildung 4. Probenchromatogramm, Vollskala.

Abbildung 5. Probenchromatogramm, vergrößerte Ansicht.

1. Experimentelle Diskussion:
2. Die Referenzmethode verwendet eine Waters T3-Säule. Aufgrund der verfügbaren Bedingungen wurden in diesem Test andere C18-Säulen geprüft; schließlich wurde eine Phenomenex Kinetex XB-C18-Säule ausgewählt. Die Methode erfüllte die experimentellen Anforderungen im Wesentlichen, obwohl die Basislinie nahe dem Zielpeak leicht uneben war.
3. Das Experiment bewertete die Eignung des CAD für die Probe anhand von Spezifität, Empfindlichkeit, Linearität und Wiederholbarkeit. Die Ergebnisse zeigen gute CAD-Empfindlichkeit, Linearität und Wiederholbarkeit und erfüllen die experimentellen Anforderungen.